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【文献解读】CRISPR敲除文库筛选助力发现TMEFF1为神经元特异性的HSV-1限制因子

CRISPR-Cas9全基因组敲除文库顺利获得控制MOI为0.3-0.4感染细胞，保证每个细胞仅进入一个sgRNA,可以同时在不同的细胞中敲除数万个基因，在基因功能研究，疾病机理研究，药物研发，基因调控研究，病毒-宿主相互作用等方面发挥重要作用。

2024年7月份，上海交通大学蔡宇伽团队与丹麦奥胡斯大学Søren R Paludan团队联合在《Nature》上发表了重要的研究成果，顺利获得全基因组敲除文库筛选HSV-1病毒入侵，复制等相关基因，研究了神经元中特异性的抗病毒机制，为抗HSV感染的研究开辟了新方向。

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种高度流行的嗜神经双链DNA病毒，可引发单纯疱疹病毒性脑炎（HSE）。HSV-1感染通常始于上皮细胞，随后扩散至感觉神经元，大多数情况下病毒复制受到控制并进入潜伏期。在极少数情况下，HSV-1可从外周神经进入中枢神经系统（CNS），引发HSE。

中枢神经系统中的细胞顺利获得血脑屏障与身体的其他部分分离出来，限制了免疫细胞和炎症成分流入中枢神经系统，同时，神经元对过度的炎症反应高度敏感，且自我更新能力有限，这些因素共同表明，神经元具有直接限制病毒复制而不激活炎症的抗病毒的方式。为了研究神经元对抗HSV-1病毒的机制，研究学者进行了全基因组筛选，体外与体内验证等试验证明了TMEFF1为限制HSV-1复制的限制性因子。

一、全基因组CRISPR筛选

（1）文库筛选

为了取得理想的筛选模型，研究人员第一时间进行预实验，结果发现神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH顺利获得核酸感应途径反应有限且对HSV-1感染不产生IFN反应，因此选择其成成为筛选模型。接着构建SK-N-SH Cas9稳转细胞株，并使用GeCKO v2 CRISPR文库感染该细胞系，顺利获得puromycin筛选7天取得敲除细胞pool和HSV-1-GFP病毒株感染敲除细胞pool。利用荧光分选出不同亮度的细胞，并使用MAGeCK对比荧光亮度较强细胞与未分选细胞的sgRNA富集程度。

顺利获得这个筛选过程，研究人员鉴定出322个候选基因，其中TMEFF1、NKX2-8和CTXN1等基因在神经组织中主要表达，因此研究人员选择以上3个候选基因进行验证。

全基因组文库筛选出TMEFF1/NKX2-8/CTXN1等基因

（2）候选基因验证--Tmeff1−/−细胞模型验证

研究人员进一步验证了这些候选基因的功能，发现TMEFF1在限制HSV-1方面具有最高效力。顺利获得在SK-N-SH细胞中敲除或过表达这些基因，检测对HSV-1复制的影响，结果表明TMEFF1的缺失导致HSV-1在神经元中的复制显著增加，神经元死亡率上升。

TMEFF1为SK-N-SH细胞HSV-1复制的限制性因子

利用CRISPR-Cas9技术在LUHMES胚胎神经前体细胞衍生的神经元和人胚胎干细胞（hESC）衍生的皮层神经元中敲除TMEFF1，并用HSV-1-GFP攻毒。结果显示，TMEFF1缺失的神经元中HSV-1的复制效率显著提高，病毒基因组的表达水平在早期就显著增加，同时伴随着更高的神经元死亡率，且仅对HSV病毒更加敏感，而对寨卡病毒，脊髓灰质炎病毒感染影响不大。

神经细胞中皮层神经元中敲除TMEFF1基因可影响HSV-1病毒复制

（3）Tmeff1−/−小鼠模型验证

研究人员使用Tmeff1基因敲除（Tmeff1−/−）小鼠进行HSV-1感染实验，观察小鼠的生存率、体重变化和疾病症状。Tmeff1−/−小鼠在HSV-1感染后生存率显著降低，体重下降更快，疾病症状更严重。特别是在大脑干中，HSV-1的载量显著增加，且这种增加主要发生在神经元中。

顺利获得免疫组化染色，发现TMEFF1缺失的小鼠大脑干中HSV-1阳性神经元的比例显著增加，而HSV-1阳性星形胶质细胞的比例没有显著变化。这进一步证实了TMEFF1在神经元中特异性地限制HSV-1感染。

基因敲除（Tmeff1−/−）小鼠验证Tmeff1是HSV-1限制性基因

二、TMEFF1基因抗HSV病毒机制研究

为了研究病毒进入机制，在HEK293T细胞中表达TMEFF1，然后用野生型HSV-1和进入缺陷突变株（ΔgD和ΔgB）感染细胞，检测病毒进入细胞的情况。结果发现TMEFF1过表达的细胞中HSV-1 DNA水平在细胞质和细胞核中均显著降低，且病毒衣壳蛋白VP5在细胞质中的积累减少。

构建TMEFF1的截短突变体和点突变体，检测其与NMHC-IIA和nectin-1的相互作用及其对HSV-1感染的抑制效果。结果显示TMEFF1的N端和C端截短突变体分别与nectin-1和NMHC-IIA的相互作用减弱，且这些突变体对HSV-1感染的抑制效果也显著降低。

利用共免疫沉淀和质谱分析技术，寻找与TMEFF1相互作用的蛋白质。发现TMEFF1与非肌肉肌球蛋白重链IIA和IIB（NMHC-IIA和NMHC-IIB) 以及nectin-1相互作用。这些蛋白质在HSV-1进入细胞的过程中起关键作用。另构建TMEFF1-C过表达细胞，测试其在HEK293T细胞和LUHMES衍生神经元中的抗HSV-1活性。TMEFF1-C肽在HEK293T细胞中表现出依赖于NMHC-IIA和NMHC-IIB的抗HSV-1活性，并且在LUHMES衍生神经元中也能有效阻断HSV-1进入细胞。

TMEFF1顺利获得与nectin-1、NMHC-IIA和NMHC-IIB的相互作用来阻止HSV-1的进入

经以上的研究发现，TMEFF1顺利获得与nectin-1（HSV-1的gD受体）和非肌肉肌球蛋白重链IIA和IIB（NMHC-IIA和NMHC-IIB，参与HSV-1进入细胞的融合过程）相互作用，阻断HSV-1的进入。具体来说，TMEFF1在病毒进入细胞的早期阶段发挥作用，顺利获得干扰病毒与细胞膜的融合，阻止病毒基因组进入细胞质和细胞核。TMEFF1不仅限制nectin-1介导的HSV-1进入，还对HVEM（另一种HSV-1进入受体）介导的进入有抑制作用，但对nectin-1介导的进入抑制效果更为显著。这表明TMEFF1顺利获得多种机制协同作用，有效限制HSV-1的感染。

综上所述，这项研究顺利获得体外和体内实验，系统地证明了TMEFF1在神经元中限制HSV-1感染的关键作用，并揭示了其顺利获得与nectin-1和NMHC-IIA/IIB相互作用来阻断HSV-1进入细胞的机制。这些发现不仅为理解HSV-1在神经系统中的感染机制给予了新的视角，还为开发新的抗HSV-1治疗策略给予了潜在的靶点，具有重要的科研和临床意义。

原文链接： http://doi.org/10.1038/s41586-024-07670-z

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