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         Prime Editing（PE,先导编辑）技术是近年来基因编辑领域的一项重大突破，它为精准基因修饰给予了全新的工具。与传统的CRISPR-Cas9技术相比，PE在编辑精度和安全性方面具有显著优势，有望在基因治疗、农业育种和基础研究等多个领域发挥重要作用。

       2023年8月，Cell杂志在线发表了题为“Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors”的研究论文。该研究由David R. Liu团队完成，结合噬菌体辅助进化和蛋白工程技术，开发了更紧凑、高效的Prime Editors（PE6），为基因编辑技术的开展给予了新的突破。

1. a. 噬菌体辅助进化（PE-PACE）：顺利获得将Prime编辑（PE）活性与噬菌体增殖直接关联，开发出高效的定向进化系统，筛选出更小、更强的逆转录酶（RT）变体。
   
   
2. b. 超紧凑型先导编辑器（PE6）：顺利获得蛋白工程和进化，成功将RT尺寸缩小至1.2-1.5 kb，同时编辑效率提升22倍，显著优于传统M-MLV RT。
   
   
3. c. 复杂编辑场景的突破：PE6编辑器在长片段插入和高二级结构模板编辑中表现优异，尤其适合双pegRNA介导的twinPE编辑。
   
   
4. d. 体内递送的成功验证：顺利获得双AAV系统，PE6在小鼠大脑皮层实现了42 bp loxP序列的高效插入（62%），较前代提升24倍。

       PE是一种无需DNA双链断裂的基因编辑技术，能够实现单碱基替换、小片段插入/删除以及长片段敲入。然而，传统PE依赖的M-MLV逆转录酶（RT）存在两个主要问题：（1）尺寸过大：M-MLV RT基因长度约2.2 kb，难以适配AAV等递送载体。（2）效率瓶颈：不同RT对复杂编辑（如长片段或高结构模板）效率差异显著，限制了其临床应用。为分析决这些问题，研究团队结合噬菌体辅助进化和蛋白工程技术，开发出新一代先导编辑器。

一、噬菌体辅助进化（PE-PACE）

       研究团队构建了一个基于T7 RNAP的定向进化系统，将RT活性与噬菌体增殖直接关联（图1）。顺利获得陆续在进化压力筛选，取得了多个高效RT变体：超小型RT：Ec48 RT（1.2 kb）经22倍效率提升，性能媲美全长M-MLV RT。高适应性变体：针对长片段/高结构模板的PE6d，在复杂编辑中效率超越传统PE3。

图1 PE-PACE的开发及验证

二、蛋白工程改造RT酶

       基于AlphaFold预测的RT结构，研究团队对关键底物结合域进行突变（图2），显著提升了DNA/RNA结合力与持续合成能力，使短RT实现长片段高效插入。

图2 突变RT关键底物结合域

三、双AAV递送系统

        利用PE6编辑器适配双AAV系统，研究人员在小鼠大脑皮层实现了38 bp attB序列插入，结果使得转导细胞中编辑效率达10.4%（图3B）。此外，也完成了42 bp loxP插入，最终效率高达62%，且脱靶率低于检测限（图3C）。

图3 PE6编辑器实现体内的编辑

四、应用场景

  1、点突变&短片段编辑

        PE6b与PEmaxΔRNaseH针对短模板优化，编辑/indel比提升2.1倍（图4D），适合高精度SNP修复。研究人员将其应用至Tay-Sachs病模型细胞中，PE6a/b实现16-53%致病突变修正（图4H）。

图4 PE6编辑器实现段突变/短片段编辑

  2、长片段敲入

        PE6c/d在双pegRNA介导的twinPE中效率提升1.6倍（图5H），支持>100 bp片段的无痕插入，可应用于重组酶识别位点安装、报告基因敲入等场景。


图5 twinPE中PE6c/d与PEmaxDRNaseH编辑效率的对比

四、应用场景

       这项研究顺利获得噬菌体辅助进化和蛋白质工程，成功开发了更紧凑、高效的Prime Editors（PE6），为基因编辑技术的开展给予了新的突破。PE6系列Prime Editors在编辑效率、编辑器尺寸和体内应用方面均表现出显著优势，为未来基因治疗给予了新的可能性。

原文链接： DOI: 10.1016/j.cell.2023.07.039

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