【客户文献】甲基化“指纹”检测，或将改变癌症早筛方式
Cas12a
结直肠癌（CRC）是全球高发的恶性肿瘤，早期筛查可显著降低死亡率。现在FDA批准的Septin9甲基化血液检测虽已实现无创筛查，但依赖复杂探针和昂贵设备，亟需更简便、低成本方案。
近期，郑州大学玉崧成团队在Biosensors and Bioelectronics上发表了题为CRISPR/Cas12a-mediated DNAzyme/split-aptamer cascade for label-free detection of site-specific DNA methylation的论文，研究针对传统 Septin9 甲基化检测依赖昂贵荧光探针、流程繁琐等痛点，构建了一种“CRISPR-Cas12a 介导 DNAzyme / 分裂光敏适配体”级联平台。
其原理是：先用甲基化敏感酶 AciI 切除未甲基化序列，仅保留的甲基化 Septin9 片段激活 Cas12a；活化的 Cas12a 反式切割 DNAzyme，使其丧失对连接链的水解能力，进而让分裂的 DAP-10 适配体重组并点亮 Auramine O 荧光，实现信号与甲基化水平正相关。
球盟会生物基因有幸为其提供高性能Cas12a蛋白，助力研究取得进展。
原文链接：http://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117720
文章亮点
1. 无标记检测，简化流程
创新性采用分体适配体+Auramine O荧光染料，无需荧光标记探针，降低成本并减少背景噪音。
2. 双重级联放大，提高灵敏度
结合Cas12a介导DNAzyme切割与适配体重构，实现信号的正向放大，检测灵敏度达 1.74 nM。
3. 临床应用潜力
在细胞系、CRC患者组织、血液样本中均取得良好区分效果，与qPCR一致性高，有望应用于无创结直肠癌早筛。
顺利获得对AO/DAP-10复合物的光谱表征，研究人员确定了其最佳荧光参数（激发/发射波长：480/540 nm）。在0–1 μM范围内，该复合物的荧光强度与DAP-10浓度呈现良好的线性关系（R² = 0.9974），表明其适用于定量检测；
在比较不同Cas12a反式切割底物时，DNAzyme展现出最高的切割效率，可在15分钟内达到最大信号强度，远快于线性ssDNA（45分钟）和G4结构DAP-10（90分钟）；
研究还验证了分裂DAP-10适配体在linker DNA存在时可有效重组并恢复荧光，而CRISPR/Cas12a系统顺利获得降解DNAzyme可保护linker完整性，从而激活荧光信号；
在甲基化检测应用中，该体系成功区分了经AciI酶处理的甲基化与非甲基化Septin9 DNA片段，甲基化样本显示出显著增强的荧光信号，凸显了该方法的高特异性和检测能力。
图1. 无标记CRISPR/Cas12a传感器用于DNA甲基化检测的可行性分析
在检测体系中，顺利获得优化实验，研究人员确定了检测体系关键组分的最优反应条件：
•荧光染料AO在20 μM时实现最大信号输出；•linker DNA浓度为750 nM时达平台期；
•DNAzyme为250 nM时信噪比较佳；
•甲基化特异性酶AciI使用2 U可彻底消化非甲基化DNA，最大限度降低背景干扰；
•Cas12a蛋白与crRNA浓度均为10 nM时取得最大荧光信号。
图2. 组分优化结果
在反应条件方面，研究确认linker DNA与分裂DAP-10片段在20°C下杂交效率最高；为同时保障酶促反应效率，整体反应温度选定为37°C，该温度下DNAzyme催化活性最强。
在此温度下，Cas12a对DNAzyme的反式切割在15分钟内即可完成，而DNAzyme对linker DNA的水解反应在10分钟内达到最大程度。上述优化条件共同确保了检测系统在灵敏度、速度和特异性之间的最佳平衡。
图3. 反应条件优化结果
在结直肠癌细胞系（HCT116 vs NCM460）、配对组织（癌/癌旁）及外周血（患者/健康人）中验证Septin9甲基化检测性能，结果与qPCR方法具有良好的一致性（R²=0.8912），证实其作为结直肠癌无创早筛工具的临床转化潜力。
图4. 实际样品检测结果
本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a、DNAzyme与分体适配体级联的无标记检测平台，成功实现了对结直肠癌关键生物标志物Septin9 DNA甲基化的灵敏检测。
该方法不仅避免了昂贵复杂的荧光标记探针，还摆脱了传统亚硫酸氢盐处理对DNA的破坏性，操作简便、成本较低。其在临床样本中的应用验证了其作为结直肠癌无创早筛工具的潜力。
未来，该方法有望结合微流控芯片或POCT设备，在基层医疗和家庭自检中推广。
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