【客户文献】CRISPR技术升级！更快、更准发现疟疾耐药基因突变
Cas12a
恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）对青蒿素的耐药性与kelch13基因突变密切相关，其中第613位密码子可发生Q613E/Q613H双碱基突变，传统PCR/测序难以在同一位点同步鉴别。现有CRISPR-Cas12a多突变检测需借助量子点、芯片等附加设备，资源受限地区难以落地。
郑州大学玉崧成教授课题组联合河南省疾控中心，在《Microchemical Journal》发表了题为“Mismatch crRNA mediated CRISPR/Cas12a system to simultaneously screen dual adjacent mutations of kelch13 gene in Plasmodium falciparum resistance to artemisinin”的论文，首次利用“错配crRNA”策略实现Q613野生型、Q613E、Q613H三型一管区分，实现kelch13基因Q613位E或H单氨基酸突变的快速、低成本、高灵敏度分型，为非洲等疟疾流行区的耐药性监测提供了新工具，并为其他病原体的复杂突变检测提供了范式。
球盟会生物基因有幸为其提供高性能Cas12a蛋白，助力研究取得进展。
原文链接：http://doi.org/10.1016/j.microc.2025.114209
文章亮点
1. 技术创新：错配 crRNA + CRISPR/Cas12a
研究提出利用错配crRNA的策略，使CRISPR/Cas12a系统能够区分 kelch13 基因的Q613、Q613E和Q613H三种基因型，在一锅反应中实现快速检测。
2. 检测优势：灵敏、高效、低成本
该方法能在30分钟内完成检测，最低可检出 20 pM 的突变型，并能区分双突变，结果与Sanger测序高度一致，适合资源有限地区应用。
3. 应用前景：疟疾耐药监测与防控
方法已在28个临床样本中验证，可用于监测青蒿素耐药相关突变，且具有扩展性，可推广至其他抗药性基因位点。
经实验确认：错配型crRNA可特异性区分kelch13基因Q613野生型与突变体（Q613E/Q613H），其中Q613因双错配不能激活Cas12a活性（信号与阴性对照相当），而Q613E/Q613H可产生强荧光信号，且Q613H因错配位点距PAM更远产生更高信号强度；
对于低丰度突变，需PCR预扩增实现有效鉴别。结果显示，该预扩增特异性良好，可将检测灵敏度提升至0.1%突变频率。
综上，错配crRNA介导的CRISPR/Cas12a系统可实现Q613位点突变的高特异性鉴别，但痕量检测需依赖预扩增。
图 1. 错配crRNA介导的CRISPR/Cas12a 可行性结果
顺利获得对实验体系的系统优化，本研究确立了一套高性能的CRISPR/Cas12a检测条件。
-
•PCR引物浓度为20 nM时信号最强，过量引物会竞争性抑制Cas12a反式切割；
-
•退火温度54°C可获最大化扩增效率；
-
•20 μL PCR体积为最优反应体系；
-
•200 nM的crRNA浓度实现最大荧光信号；
-
•37°C反应温度在保障Cas12a酶活的同时维持错配识别特异性。
这一系列条件的优化显著提升了检测体系的整体性能和可靠性。
图 2. 条件优化结果
错配crRNA介导CRISPR/Cas12a体系对Q613E突变体的检测限达20 pM，可显著区分野生型Q613；在混合样本中成功鉴别低至1%丰度的Q613E/Q613H突变，且Q613H因错配距离效应产生更高信号。
该方法突破性地实现单管体系内双碱基突变（Q613E与Q613H）同步鉴别，无需复杂仪器支持，证实其作为床旁检测（POCT）工具的潜力。
图 3. 方法性能评价结果
应用错配crRNA介导的CRISPR/Cas12a系统对28例临床样本进行kelch13基因分型：
-
•预扩增凝胶电泳证实所有样本靶片段有效扩增；
-
•CRISPR检测显示样本1-4存在显著突变信号，其中样本1-3信号强度相当（判为Q613E突变），样本4信号显著更强（判为Q613H突变），样本5-28为野生型Q613；
-
•Sanger测序验证一致性达100%。
以上结果充分证明了本方法在实际临床样本中具备出色的准确性与可靠性，为疟疾抗药性的现场快速筛查提供了可靠的技术支持。
图 4. 实际样品检测结果
本研究提出了一种基于错配 crRNA 的 CRISPR/Cas12a 检测平台，实现了对 kelch13 基因 Q613、Q613E 和 Q613H 突变的一锅式快速检测。该方法兼具高灵敏、快速与低成本的优势，为资源有限地区的疟疾耐药筛查提供了可行方案。
未来，该技术或将拓展至其他与耐药性相关的关键位点检测，同时结合现场检测设备与便携式读数装置，可开展成为面向基层医疗和防控前线的即用型工具，为疟疾耐药的早期预警与全球防控策略提供重要支持。
球盟会生物基因拥有自主研发蛋白质表达纯化平台，经活性测试本公司的Cas酶产品活性明显优于市面上其他的酶，真正实现高纯度、高活性、高灵敏度酶产品的制备。更有恒温快速扩增试剂盒、CRISPR检测试剂盒现货，设备要求低，反应时间短，下单即达！
联系电话
Comment (4)