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细胞复苏方法

注意：收到的细胞如 24h 内复苏，可存放于-80℃冰箱；超过 24h 请存放于液氮中，复苏前 10min 取出，放于-80℃，让管中液氮挥发。 1．水浴锅 37℃预热； 2．适合该细胞系的完全培养基温浴到 37℃； 3．在 15mL 离心管中加入 6mL 完全培养基备用； 4．从-80℃冰箱中取出细胞，在 37℃水浴中轻轻转动冻存管，直到冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞在 1min 内迅速解冻（水不能没过盖子或用封口膜把冻存管口封上）； 5．将冻存管转移到超净工作台内；打开盖子前，用 75％酒精擦拭冻存管外部； 6．用移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至已预热的完全培养基的离心管内； 7．用 1mL 完全培养基洗涤冻存管 1 次，收集残留细胞，减少损失； 8． 细胞悬液以 1100rpm 离心 4min（离心速度和时间取决于细胞种类） 9．离心后，检查上清液是否清澈，有无完整的细胞沉淀；在无菌条件下，小心倒掉上清液，加入 1mL 完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀； 10．将细胞平均接种到 1 个 T25 培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基，1 个 T25 培养瓶中培养基总量不少于 6mL（实际培养瓶尺寸取决于冻存管冻存的细胞数量）； 11．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中（培养环境取决于细胞和培养基类型）； 12．复苏次日，观察细胞状态。 （1）贴壁细胞若细胞贴壁情况良好，可以更换新鲜的完全培养基；若观察到细胞呈圆亮形态但不贴壁，可以让细胞继续培养 24h 后再进行换液操作。之后，根据细胞的生长状况，每2-3 天更换一次完全培养基，观察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代。若细胞生长较慢或汇合度较低时，可以减少换液次数。 （2）悬浮细胞复苏后尽量放在相对小一些的容器中，使用含 20％血清的培养基复苏。悬浮细胞若细胞状态良好，可以更换新鲜的完全培养基；若细胞状态差且呈现灰度，可以继续培养 72h 后再观察细胞。观察发现有活细胞，可进行换液操作，观察细胞无明显变化，及时反馈本公司售后。

细胞传代方法

1．将完全培养基、PBS、胰酶预热至 37℃； 2．从培养容器中吸弃上清； 3．从容器一侧轻轻加入冲洗液 PBS（T25 培养瓶加入约 6mL）洗涤细胞 1 次。注意动作轻柔，清洗全面，避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次吸去 PBS（注：冲洗步骤可去除可能抑制解离剂作用的少量血清、钙和镁）； 4．加入胰酶（T25 培养瓶加入约 3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。放入培养箱消化； 5．显微镜下观察消化情况，约 70％～80％细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面； 6．立即加入 2 倍胰酶体积的完全培养基（T25 培养瓶加入约 6mL），随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化； 7．使用移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来；注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，损伤和损失细胞。 8．将细胞悬液转移至离心管中。用 PBS（T25 培养瓶加入约 3mL）洗涤容器 1 次，收集残留细胞； 9．收集的所有细胞悬液以 1100rpm 离心 4min； 10．离心后去除上清。加入 1mL 完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀； 11．将细胞按一定的比例传代接种，建议首次按照 1：3 进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例； 注意：请根据细胞实际生长情况调整传代比例。 12．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中（如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖）； 13．传代次日，观察细胞状态。若发现较多死细胞，进行换液操作。之后，每根据细胞的生长情况更换完全培养基，观察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代或冻存。

储存条件

液氮保存